Los procesos de centrifugado

Existen dos métodos de separación en centrifugación:

A.- Centrifugación diferencial.
B.- Centrifugación en gradiente de densidad.

Coeficiente de sedimentación (s)

La velocidad de sedimentación de una partícula depende del campo centrífugo aplicado. Es un parámetro útil para caracterizar una partícula y puede ser determinada en una ultracentrífuga.

Se define coeficiente de sedimentación (s) como la velocidad de sedimentación por unidad de fuerza centrífuga. Ésta depende de la masa y densidad de la partícula; de la densidad del medio y del coeficiente de fricción, que depende a su vez de la forma de la partícula. El coeficiente de sedimentación(s) es directamente proporcional a la masa de la partícula (m) e inversamente proporcional al coeficiente de fricción (f) de la misma.

S α m/f

La unidad se denomina Svedberg, (S)

1 S= 10-13 seg., en H2O a 20 ºC

La centrifugación diferencial

En este método, el tubo de centrífuga se llena con una mezcla uniforme problema. Tras la centrifugación se obtienen dos fracciones: un pellet que contiene el material sedimentado y un sobrenadante con el material no sedimentado. Es una técnica muy útil, sobre todo para aislamiento de células y orgánulos subcelulares. Es un tipo de separación logrado en base al tamaño de las partículas.

Esta técnica consiste en someter a una muestra heterogénea de partículas a fuerzas de centrifugación crecientes por períodos de tiempo crecientes. Los precipitados obtenidos luego de cada centrifugación estarán enriquecidos en una determinada partícula.

Para lograr la separación, los coeficientes de sedimentación de las partículas deben diferir en al menos un factor de tres (moléculas con s mayores precipitan primero).

La centrifugación en gradiente de densidad

El método de gradiente de densidad implica la utilización de un soporte fluido, cuya densidad aumenta desde la zona superior a la inferior. El gradiente se consigue con un soluto preferiblemente de baja masa molecular en un solvente en el que la muestra a analizar pueda ser suspendida. La muestra se sitúa en la parte superior del gradiente como una fina banda. La separación de los componentes de la muestra se presenta como diferentes bandas o zonas. Existen dos variaciones dentro de la centrifugación en gradiente de densidad:

Estas técnicas permiten la separación de partículas y moléculas que difieren en masa o densidad.

La centrifugación de equilibrio en gradiente o isopícnica

La centrifugación de equilibrio en gradiente separa las partículas con base en sus densidades diferentes. En esta técnica la muestra es disuelta en una solución isocrática y bajo la fuerza centrífuga el soluto forma el gradiente al distribuirse en el tubo durante la centrifugación, se denominan autoformados. La condición fundamental es que la densidad máxima del gradiente final debe siempre exceder a la densidad de las partículas. La centrifugación de equilibrio en gradiente permite que las especies sedimentantes se muevan por el gradiente hasta que alcanzan un punto donde su densidad y la del gradiente son idénticas, por lo cual también se le llama centrifugación isopícnica. En este punto no se producirá una sedimentación posterior debido a que flotan sobre un "colchón" de material que posee una densidad superior que la suya propia de tal manera que aunque se prolongue el tiempo de centrifugación, las partículas no van a ir al fondo del tubo. La densidad de la partícula en ese punto se conoce como “buoyant density”. Esta técnica se emplea para separar partículas similares en tamaño pero distintas en densidad. Esto es cierto para moléculas, tales como ácidos nucleícos, así como diferentes orgánulos celulares.

Se requieren las siguientes características en los solutos usados para formar el gradiente: bajo PM (de manera que el tiempo requerido para lograr el equilibrio sea corto), bajo grado de ionización, baja viscosidad y alta densidad, transparencia a la luz UV, y ser buen solvente para las moléculas que se intentan resolver. Frecuentemente se usa CsCl, el Cs+, por ser un ión compacto, sedimenta lentamente en los altos campos gravitacionales aplicados durante la centrifugación y se establece un gradiente con la mayor concentración en el fondo del tubo (el ión Cl- lo sigue de manera de mantener la neutralidad de las cargas). Por otro lado el Cs+ se une a los fosfatos del DNA y RNA y a los grupos OH- de las ribosas de manera que la densidad de las moléculas de RNA se incrementa más que la del DNA. La densidad aproximada en CsCl de proteínas es 1.3 g/ml; del DNA 1.6 - 1.7 g/ml y del RNA es 1.75 - 1.85 g/ml. Los gradientes de CsCl permiten separar moléculas cuyas densidades difieren en por lo menos 0.02 g/ml.

En los medios de separación suelen incluirse también Hg++ o Ag+, con el propósito de aumentar las diferencias entre las densidades de las moléculas (a pH neutro el Hg++ se une a T y A, y el ión Ag+ se une a G y C). El agregado de compuestos intercalantes como el bromuro de etidio permiten separar moléculas de DNA de distinta conformación aunque tengan la misma composición de bases.

Moléculas con una alta proporción de G y C poseen mayor densidad como consecuencia de los tres puentes H formados.

La siguiente ecuación relaciona el % de G+C con la densidad (?) de la molécula:

% (G+C)= [(?- 1.66)/0.098] 100

La centrifugación zonal

La muestra a analizar se deposita en la parte superior de un gradiente de densidad preformado. Bajo fuerza centrífuga las partículas comenzarán a sedimentar a través del gradiente, moviéndose cada partícula a diferentes velocidades dependiendo de su masa. La migración depende de: el tamaño y forma de las partículas, la fuerza centrífuga aplicada, y la densidad y viscosidad del medio. La propiedad física sobre la que se fundamenta la separación es la masa de las partículas, y no su densidad. A diferencia de lo que ocurre en la centrifugación isopícnica, la densidad máxima del gradiente no debe exceder la de las partículas a separar. Los gradientes de densidad impiden que las bandas de cada componente se ensanchen por efecto de corrientes convectivas y se mezclen durante la aceleración y desaceleración del rotor. Frecuentemente se usan con este propósito gradientes de sacarosa, más densos en el fondo que en la parte superior del tubo; otros medios usados con este fin son: glicerol, Ficoll, Percoll. En general se usan rotores de tipo swing-out. Las muestras son centrifugadas lo suficiente como para separar las moléculas de interés; si la centrifugación se prolonga en el tiempo las partículas se recuperan en el pellet, como se muestra en el siguiente gráfico:

Diagrama de representación de la velocidad de la centrifugación zonal e isopicnica
ρ1: Densidad boyante de partículas de menos densidad
ρ2: Densidad boyante de partículas de más densidad

Con la finalidad de obtener separaciones adecuadas de los componentes de las mezclas es necesario que la velocidad y el tiempo de centrifugado sea el adecuado para lo cual el equipo en el cual se llevará a cabo el proceso deberá estar debidamente calibrado, en cuanto a revoluciones por minuto y a tiempo de centrifugado, para lo cual Instrumentos Científicos y de Laboratorio (ICLAB), cuenta con personal calificado para verificar y calibrar este tipo de equipos

Instrumentos Científicos y de Laboratorio S. A. de C. V., (ICLAB), es una empresa con la misión de proporcionar servicios de calibración y calificación de la más alta calidad a equipos e instrumentos, cumpliendo con los requerimientos de normas y recomendaciones nacionales e internacionales.

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¿Cómo obtener agua de alta pureza?

La calidad de agua que se emplea en laboratorios de análisis es determinante en la calidad de sus resultados.

Los laboratorios de investigación y desarrollo tecnológico en centros de investigación o en universidades, requieren de agua de óptima calidad para eliminar variables ocultas en los resultados de sus análisis.

Así mismo, los equipos e instrumentos como cromatógrafos de gases y de líquidos, espectrómetros de absorción y emisión atómica, deben operar con agua con la cual se tenga la absoluta certeza de la ausencia de contaminantes y componentes que puedan interferir con los resultados del análisis.

También en análisis clínicos, en trabajos con cultivos celulares o con fluidos bioquímicas es indispensable el uso de agua de la mejor calidad y pureza.

¿Qué componentes se deben remover del agua?

Las aguas potables que provienen de la red de suministro en las diferentes ciudades, contienen sólidos disueltos y sólidos suspendidos.

Los sólidos suspendidos son partículas sólidas que pueden estar presentes en el agua, aunque siempre en cantidades mínimas, pero que deben removerse para obtener agua de alta pureza. Para este fin se emplean filtros que por tamizado mecánico retienen las partículas suspendidas y dejan pasar el agua clarificada.

Los sólidos disueltos no pueden removerse por medios mecánicos simples y deben emplearse tecnologías tales como; osmosis inversa, desmineralización en lechos mixtos de resina cationaica y aniónica o electrodeionización.

En la práctica para obtener agua de alta pureza se emplean combinaciones de uno o más de estos procesos, como pueden ser la osmosis inversa seguido de la deionización en lechos de resina mixta.

La esterilización del agua también es importante para evitar la presencia de esporas y para controlar el crecimiento microbiano, sobre todo cuando el agua está en almacenamiento en un depósito para ser empleada cuando sea necesario.

Para este fin se debe disponer de un sistema de recirculación que haga fluir el agua a través de un esterilizador ultravioleta y un filtro de 1.0 micras o menos con la finalidad de remover esporas y desinfectar continuamente el agua con irradiación UV de 254 nm de intensidad.

Los accesorios y componentes de un equipo de producción de agua ultrapura y algunas de las sustancias presentes en el agua causan que esta agua contenga trazas de materia orgánica que es irrelevante cuando se determinan metales o el agua se emplea para preparación de soluciones para uso del laboratorio pero que son indeseables en análisis por cromatografía de gases o de líquidos, o en cultivo y desarrollo de tejidos celulares y por esto es necesario su remoción.

Para esto se emplea una lámpara UV que emite principalmente la banda UV de 185 nm que reacciona fotoquímicamente con los componentes químicos residuales de la materia orgánica y los convierte a CO2 y H2O.

En forma conjunta con este tratamiento, se emplea un filtro de carbón activado, el cual tiene la propiedad de adsorber compuestos orgánicos presentes en al agua.

Un resumen de los componentes que deben removerse de las aguas naturales, así como su origen y técnicas de remoción es la que se presenta en la siguiente tabla:

Componentes y técnicas de remoción para producción de agua ultrapura

Proveedores de sistemas para obtención de agua ultra pura

A continuación le presentamos a Festa-Hidrogel, proveedor de sistemas para obtención de agua ultra pura:

Festa-Hidrogel es una empresa cuyo giro principal es en el tratamiento y acondicionamiento de aguas potables y residuales. Dentro de sus principales divisiones se encuentra el de sistemas para obtención de agua ultra pura, que es necesario cuando se demanda agua con un mínimo de sales y compuestos similares que disminuyen su grado de pureza.

Conozca el Perfil, Productos, Dirección y Teléfono de Festa-Hidrogel.

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Selección y uso de Solventes en cromatografía HPLC

La cromatografía es un método físico de separación basado en la distribución de los componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija o estacionaria y otra móvil. En cromatografía líquida, la fase móvil es un líquido que fluye a través de una columna que contiene a la fase fija.

La fase móvil puede ser un solvente puro o una mezcla de solventes. Cuando se trata de una mezcla, puede programarse la bomba para que tome solventes de diferentes botellas en una proporción determinada y realice la mezcla en una cámara de mezclado.

Dependiendo de la forma en que se usa el solvente tenemos dos métodos:

Cuando durante toda la separación se utiliza siempre el mismo solvente, se denomina isocrática, sin embargo es normal realizar un gradiente de composición del solvente a lo largo de la cromatografía para mejorar la eficiencia y acortar la duración del proceso. Estos gradientes de solvente también son realizados en forma automatica por las bombas.

Es un término que se utiliza para describir el proceso mendiante el cual se cambia la composición de la fase móvil. Pueden efectuarse de dos maneras:

Cuando se desarrolla un análisis usando el método de gradiente se debe tener presente dos objetivos:

Para obtener buenos resultados con el método de gradiente debemos seguir cinco pasos fundamentales:

 
La bomba envía al solvente a través de caños de diámetro pequeño, generalmente de acero inoxidable, hacia la válvula inyectora. Esta consiste en una válvula de varias vías que permite introducir en el flujo de solvente, la muestra contenida en un aro o loop de volumen calibrado.

Luego de que se produzca la separación en la columna, los componentes de la mezcla pasan por el detector. Este produce una señal eléctrica proporcional a la cantidad de materia y esa señal es enviada al registrador que realiza un gráfico de intensidad en función del tiempo (cromatograma). Idealmente, se trata de picos gaussianos y cada pico corresponde a un componente de la muestra original. El integrador calcula además el àrea correspondiente a cada pico, la cual es proporcional a la cantidad de sustancia.

Dado que los detectores de HPLC son no destructivos, es posible recuperar los productos que salen de él. De esta manera, dependiendo del tamaño del loop de inyección y de la columna, y del tipo de bomba, es posible realizar además de separaciones analíticas, cromatografías preparativas.

Criterios para la elección del solvente:

- Disponible comercialmente
- Precio
- Pureza y Estabilidad. En la actualidad contamos con productos de calidad de pureza cromatográfica. Bajo contenido de impurezas.
- Disolver la muestra
- Misible con otros solventes para formar mezclas útiles
- No degradar o disolver la fase estacionaria
- Tener baja viscosidad para reducir las caídas de presión
- Ser compatible con el detector utilizado. Transparencia óptica (cuando se usan detectores UV)
- Filtración y Desgasificación de solventes

InTechMex – Instrumental Technologies de México ofrece cromatógrafos HPLC y todos sus aditamentos como bombas, splitters, mezcladoras, reactores post-columna, filtros, uniones y todo lo que usted pueda requerir para la operación de su cromatógrafo.

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